免疫组化流程通过组织处理、抗原修复、抗体孵育及显色观察四阶段精准定位疾病标志物，需严格控温、脱水及封闭条件确保结果可靠，适用于肿瘤分型与耐药基因检测。
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标本预处理阶段：首先对组织或细胞标本（常为石蜡切片）进行固定、脱水及石蜡包埋，确保抗原保存完整。切片需脱蜡至水，通过梯度乙醇充分清洗，随后用高压、微波或酶解法修复因固定而封闭的抗原位点，恢复组织抗原反应活性。
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封闭与抗体孵育流程：以封闭液抑制非特异性结合后，滴加特异性一抗与组织抗原结合，需在4℃孵育过夜以提升反应效率。次日以标记二抗（如过氧化物酶或荧光素）覆盖，室温孵育强化信号，二抗选择需与一抗来源匹配以提高精度。
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显色与观察环节：利用酶底物显色反应（如DAB）或荧光标记可视化抗原分布，常规镜检结合图像分析确认目标蛋白表达强度及位置。关键质控步骤包括设置阳性对照及抗体稀释液pH值校准，避免假阴性/阳性。
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技术适配与局限性：免疫组化侧重形态学与功能协同分析，虽检测灵敏度优于ELISA和Western blot，但对膜蛋白显色弱于免疫荧光。实际操作需规范温控及试剂时效，针对不同蛋白（如紧密连接蛋白ZO-1）差异选择冻片或石蜡切片。
免疫组化作为病理诊断核心工具，涵盖从标本制备到数据分析的全链条标准化操作，其准确度高度依赖人员经验和质控节点，尤其在肿瘤分型中需结合多标记联检提升可靠性，助力临床治疗方案制定及预后评估。