DNA的粗提取与鉴定是生物学实验中的一个基础课题,旨在通过简单的实验方法提取和鉴定DNA。以下将详细介绍DNA粗提取与鉴定的实验原理、步骤、结果分析及注意事项。
实验原理
DNA的溶解度
DNA在NaCl溶液中的溶解度随NaCl浓度的变化而变化。当NaCl的物质的量浓度为0.14mol/L时,DNA的溶解度最低,利用这一原理可以使DNA析出。DNA的溶解度特性是粗提取的关键,通过调节NaCl浓度可以实现DNA的析出和纯化。
DNA与细胞内其他成分的分离
DNA不溶于95%的酒精溶液,但细胞中的某些物质可以溶于酒精。利用这一原理,可以进一步提取出含杂质较少的DNA。通过酒精沉淀可以有效地将DNA与细胞内其他成分分离,提高DNA的纯度。
DNA的鉴定
DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成蓝色,因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。二苯胺染色是DNA鉴定的一种简便有效的方法,通过观察颜色变化可以确认DNA的存在。
实验步骤
制备鸡血细胞液
将质量浓度为0.1g/mL的柠檬酸钠溶液100mL置于500mL烧杯中,注入新鲜的鸡血(约180mL),用玻璃棒搅拌,使其充分混合,静置于冰箱内一天或离心2分钟,用吸管吸去上清液。
制备鸡血细胞液是实验的第一步,确保血液与抗凝剂充分混合,防止凝血,为后续提取DNA奠定基础。
提取细胞核物质
取制备好的鸡血细胞液5mL至50mL烧杯中,加入蒸馏水20mL,用玻璃棒充分搅拌5分钟,使血细胞加速破裂,然后过滤至500mL烧杯中。通过搅拌和过滤,细胞内的DNA和其他成分被分离,收集到滤液中。
溶解DNA
将2mol/L的NaCl溶液40mL加入到滤液中,摇动烧杯使其混合均匀,DNA在溶液中呈溶解状态。高浓度的NaCl溶液使DNA溶解,去除细胞膜和核膜等杂质。
析出DNA
沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水,同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌,至白色丝状粘稠物不再增加时停止加水。通过逐渐降低NaCl浓度,DNA析出形成粘稠物,这一步骤是实验的关键。
过滤和再溶解
用多层纱布过滤步骤3中的溶液至500mL的烧杯中,含DNA的粘稠物被留在纱布上。将粘稠物再溶解于2mol/L的NaCl溶液中,过滤去除杂质。过滤进一步去除杂质,再溶解使DNA纯化,准备后续鉴定。
DNA的鉴定
取两支20mL的试管,各加入物质的量浓度为0.015mol/L的NaCl溶液5mL,将丝状物放入其中一支试管中,用玻璃棒搅拌,使丝状物溶解,然后加入4mL的二苯胺试剂,沸水浴加热5分钟,观察颜色变化。
通过二苯胺染色鉴定DNA,蓝色溶液表明提取成功。
实验结果分析
颜色变化
在沸水浴中加热后,含有DNA的试管溶液变成蓝色,而对照试管溶液不变色。这表明提取出的物质是DNA。颜色变化是鉴定DNA的直接证据,蓝色溶液表明DNA的存在。
纯度分析
通过超微量紫外可见分光光度计检测,纯化后的DNA其OD260/OD280比值应在1.8左右,OD260/OD230比值应在2.0左右,表明DNA纯度高。
纯度分析可以进一步确认DNA的提取效果,高纯度DNA适合用于后续的基因工程实验。
实验注意事项
实验操作细节
实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌,但是在不同的步骤中玻璃棒的用法不同。例如,在步骤3中加入蒸馏水时要逆时针方向搅拌,缓慢加入。严格按照实验步骤操作,注意玻璃棒的使用方法,确保实验成功。
实验材料的选择
选用DNA含量相对较高的生物组织,如鸡血、菜花、洋葱等,可以提高实验成功率。选择合适的实验材料是实验成功的关键,高DNA含量的材料可以减少实验难度。
实验安全与防护
在实验中使用二苯胺试剂时,要注意不要让药液接触到皮肤或身体的其他部位,也不要近距离观察。实验过程中要注意安全防护,避免有毒试剂对身体的伤害。
DNA的粗提取与鉴定实验通过简单的操作步骤,成功地提取并鉴定了DNA。实验原理基于DNA的溶解度和与细胞内其他成分的分离,实验步骤包括制备鸡血细胞液、提取细胞核物质、溶解DNA、析出DNA、过滤和再溶解以及DNA的鉴定。实验结果通过颜色变化和纯度分析进行确认,实验过程中需注意操作细节、材料选择和实验安全防护。
