江苏定线制最新规定是交通运输部 2021 年 3 月 30 日发布的《长江江苏段船舶定线制规定（2021 年）》，于当年 7 月 1 日正式实施。以下是部分主要内容：
- 适用范围：长江上界南岸慈湖河口（31°46′30″N/118°29′48″E）与北岸乌江河口（31°50′42″N/118°29′24″E）联线，下界浏河口下游的浏黑屋（31°30′52″N/121°18′54″E）与崇明岛施翘河下游的施信杆（31°37′34″N/121°22′30″E）联线间海事管理机构公布的可供船舶航行的水域。但正在执行公务的船舶、在核定水域内在航施工的工程船舶、进行海难救助的船舶以及经海事管理机构批准的船舶除外。
- 航道、航路：
- 通航分道及分隔带（线）：在深水航道内设置上、下行通航分道和分隔带（线）。泰桥左右通航浮至慈湖河口航段，深水航道宽度不足 500 米时，深水航道的中心线为分隔线；大于 500 米时，在深水航道中心线航道左侧设置宽度为 50 米的分隔带。
- 推荐航路：设置在深水航道侧面标的外侧水域，主要供小型船舶使用。黑浮联线外侧设置上行船舶推荐航路；红浮联线外侧设置下行船舶推荐航路。
- 临时调整：由海事管理机构以航行通（警）告形式发布。船舶正常航行时最高航速不得超过 15 节（约 28 千米 / 小时）；通航分道内，逆流最低航速不得低于 4 节（约 7.5 千米 / 小时），顺流最低航速不得低于 6 节（约 11 千米 / 小时）。
- 船舶行驶规定：
- 船舶应在规定的通航分道或航路内行驶。大型船舶、高速船应在规定的通航分道内行驶。大型船舶在经过通航条件受到限制的水域前，或自身操纵能力受到限制时，可选择航路行驶，驶过后应及时恢复到规定的通航分道内行驶。
- 船舶驶经福姜沙水道、尹公洲航段、桥区水域等特殊水域，应遵守海事管理机构颁布的相关规定。横江渡轮和靠离码头、进出锚地等需横越通航分道、推荐航路的船舶，应当注意航道情况和周围环境，在不妨碍他船安全行驶的情况下，尽可能与通航分道、推荐航路成大角度就近进行。
- 航行于 12.5 米深水航道的受限船舶应遵守海事管理机构制定的相关规定。船舶应按照规定配备船舶自动识别系统（AIS）设备，并使其处于正常工作状态。
- 船龄 26 年及以上的油船、散装液体化学品船（双底双壳的油船及达到 2 型船舶及以上标准的散装液体化学品船除外）；载运闪点小于 23℃散装液体化学品的船舶；载运污染类别为 X 类强污染物质的散装液体化学品船舶；载运散装液化气体的船舶，应尽可能避免在长江江苏段夜间航行。
- 避让规定：
- 船舶会让时，未按规定在通航分道、推荐航路内行驶的船舶，进出汊河口、支流及专用航道的船舶，横江渡轮和靠离码头、进出锚地等的船舶，应主动避让在规定的通航分道、推荐航路内正常行驶的船舶。
- 沿规定通航分道、推荐航路行驶的船舶，在经过桥区水域、渡口渡运水域等之前，应保持高度警惕，加强瞭望，谨慎行驶，注意横越船动态，并提前采取减速、停车等有效措施协助避让。
该规定还对停泊与报告要求等方面进行了明确，以维护长江江苏段水上交通秩序，改善通航环境，提高交通效率，保障航行安全，促进航运发展。